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一、目的：
1．學習SDS—PAGE測定蛋白質分子量的基本原理。
2．掌握垂直板型電泳的基本操作技術。
二、原理：
由實驗十五中已知，蛋白質在聚丙烯酰胺凝膠中電泳時，它的遷移率取決于它所帶凈電荷以及分子的大小和形狀等因素。
1967年，Shapiro等人發(fā)現，如果在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中加入陰離子去污劑十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfate，簡稱SDS），則蛋白質分子的電泳遷移率主要取決于它的分子量，而與所帶電荷和形狀無關。在一定條件下，蛋白質的分子量與電泳遷移率間的關系，可用下式表示：
因此，測定某個蛋白質的分子量，只需比較它和一系列已知分子量的蛋白質在SDS-凝膠電泳時的遷移率就可以了。后來，Weber等人基本按Shapiro的方法對約40種蛋白質進行了研究，進一步證實了這個方法地可行性(見圖16-1)。用這種方法測定蛋白質的分子量，簡便、快速，只需要廉價的設備和微克量的蛋白質樣品；所得結果，在分子量為15,000—200，000的范圍內，與用其他方法測得的分子量相比，誤差一般在±10%以內。因此，近幾年來，SDS-凝膠電泳測定分子量的方法，已得到非常廣泛的應用和迅速的發(fā)展。
為了闡明SDS-凝膠電泳法測定蛋白質分子量的原理，許多人進行了深入的研究。實驗證明，在蛋白質溶液中加入SDS和巰基乙醇后，巰基乙醇能使蛋白質分子中的二硫鍵還原；SDS能使蛋白質的氫鍵、疏水鍵打開，并結合到蛋白質分子上，形成蛋白質-SDS復合物。在一定條件下，SDS與大多數蛋白質的結合比為1.4克SDS/1克蛋白質。由于十二烷基磺酸根帶負電，使各種蛋白質的SDS-復合物都帶上相同密度的負電荷，它的量大大超過了蛋白質分子原有的電荷量，因而掩蓋了不同種類蛋白質間原有的電荷差別。
SDS與蛋白質結合后，還引起了蛋白質構象的改變。蛋白質-SDS復合物的流體力學和光學性質表明，它們在水溶液中的形狀，近似于雪匣煙形的長橢圓棒，不同蛋白質的SDS復合物的短軸長度都一樣，約為18A，而長軸則隨蛋白質的分子量成正比地變化。
這樣的蛋白質-SDS復合物，在凝膠電泳中的遷移率，不再受蛋白質原有電荷和形狀的影響，而只是橢圓棒的長度也就是蛋白質分子量的函數。
將蛋白質-SDS復合物在不同濃度的SDS-凝膠中電泳，得到的結果按Ferguson公式作圖，也證明了蛋白質-SDS復合物的上述性質。
Ferguson公式：1gmR=1gm0—KRC
該公式原來是Ferguson提出來描述蛋白質在淀粉凝膠中電泳行為的，后來證明它也同樣適用于聚丙烯酰胺凝膠電泳，式中mR是蛋白質在一定濃度凝膠（C）中的遷移率；m0是當凝膠濃度外推到零時的遷移率即自由遷移率，它與蛋白質的凈電荷量（q）成正比，與蛋白質在溶液中的摩擦系數（f）成反比（m0∝q/f，f由溶液的粘滯性、蛋白質分子的大小和形狀決定）；KR是阻滯系數（retardation coefficient），它與蛋白質分子量成線性關系。因此，不同的蛋白質分子有不同的mR，m0和KR值，幾種蛋白質的Ferguson圖見圖16-2。
而蛋白質-SDS復合物的Ferguson圖則不同（見圖16-3）。
從圖16-3可以清楚地看到，不同蛋白質的SDS復合物的m0值都很接近，分子量相差5倍的蛋白質之間，m0值只相差10%，如果忽略這個差別，就可以認為，各種蛋白質-SDS復合物的m0基本上是一個定值。這表明，不同蛋白質的SDS復合物都帶有相同密度的負電荷，并具有同樣的構象，因此，它們的凈電荷量與磨擦系數之比（q/f）都接近于一個定值而不受各種蛋白質原來的電荷、分子大小和形狀的影響，因而，在溶液中，自由遷移率就表現出一致性；但在一定濃度的凝膠中，由于引入了凝膠的分子篩效應，電泳遷移率mR就成為蛋白質分子量的函數。
根據以上事實，可以認為SDS-凝膠電泳測定蛋白質分子量方法的基礎是可靠的。當然，還有許多問題有待于更深入地研究。
在用SDS-凝膠電泳法測定蛋白質分子量時，應注意以下幾個問題：
1．如果蛋白質-SDS復合物不能達到1.4克SDS/1克蛋白質的比率并具有相同的構象，就不能得到準確的結果。影響蛋白質和SDS結合的因素主要有以下3個：（1）二硫鍵是否完全被還原：只有在蛋白質分子內的二硫鍵被徹底還原的情況下，SDS才能定量地結合到蛋白質分子上去，并使之具有相同的構象。一般以巰基乙醇作還原劑。在有些情況下，還需進一步將形成的巰基烷基化，以免在電泳過程中重新氧化而形成蛋白質聚合體。（2）溶液中SDS的濃度：溶液中的SDS的總量，至少要比蛋白質的量高3倍，一般需高達10倍以上。（3）溶液的離子強度：溶液的離子強度應較低，最高不能超過0.26，因為SDS在水溶液中是以單體和分子團的混合體而存在的，SDS結合到蛋白質分子上的量，僅決定于平衡時SDS單體的濃度而不是總濃度，在低離子強度的溶液中，SDS單體具有較高的平衡濃度。
2．不同的凝膠濃度適用地不同的分子量范圍，Weber的實驗指出，在5%的凝膠中，分子量25,000—200,000的蛋白質，其分子量的對數與遷移率呈直線關系；在10%的凝膠中，10.000—70,000分子量的蛋白質呈直線關系；在15%的凝膠中，10,000—50,000分子量的蛋白質呈直線關系；3.33%（以上各種濃度的凝膠，其交聯度都是2.6%）的凝膠可用于分子量更高的蛋白質。
可根據所測分子量范圍選擇最適凝膠濃度，并盡量選擇分子量范圍和性質與待測樣品相近的蛋白質作標準蛋白質。標準蛋白質的相對遷移率（蛋白質的電泳遷移距離除以染料遷移距離即為相對遷移率，詳見后）最好在0.2—0.8之間均勻分布。
在凝膠電泳中，影響遷移率的因素較多，而在制膠和電泳過程中，很難每次都將各項條件控制得完全一致，因此，用SDS-凝膠電泳法測定分子量，每次測定樣品必須同時做標準曲線，而不得利用另一次電泳的標準曲線。
3．有許多蛋白質，是由亞基（如血紅蛋白）或兩條以上肽鏈（如α-胰凝乳蛋白酶）組成的，它們在SDS和巰基乙醇的作用下，解離成亞基或單條肽鏈。因此，對于這一類蛋白質，SDS-凝膠電泳測定的只是它們的亞基或單條肽鏈的分子量，而不是完整分子的分子量。為了得到更全面的資料，還必須用其它方法測定其分子量及分子中肽鏈的數目等，與SDS-凝膠電泳的結果互相參照。
4．不是所有的蛋白質都能用SDS-凝膠電泳法測定其分子量，已發(fā)現有些蛋白質用這種方法測出的分子量是不可靠的。這些蛋白質有：電荷異?；驑嬒螽惓５牡鞍踪|，帶有較大輔基的蛋白質（如某些糖蛋白）以及一些結構蛋白如膠原蛋白等。例如組蛋白F1，它本身帶有大量正電荷，因此，盡管結合了正常比例的SDS，仍不能完全掩蓋其原有正電荷的影響，它的分子量是21,000，但SDS-凝膠電泳測定的結果卻是35,000。因此，在分析SDS-凝膠電泳所得的結果時，應該小心。一般至少用兩種方法來測定未知樣品的分子量，互相驗證。為了判斷待測樣品是否可用SDS-凝膠電泳法來測定分子量，也可以使蛋白質-SDS復合物在不同濃度（交聯度相同）的SDS-凝膠中電泳，得到Ferguson圖。如果待測樣品的自由遷移率m0與標準蛋白質的m0基本交于一點（如圖16-3），而且在不同濃度的SDS-凝膠中測得的分子量都相同，則表明此蛋白質在SDS-凝膠電泳中的行為是正常的，可以用SDS-凝膠電泳法測定其分子量。
SDS-PAGE有連續(xù)體系及不連續(xù)體系兩種，這兩種體系有各自的樣品溶解液及緩沖液，但加樣方式，電泳過程及固定、染色與脫色方法完全相同。
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