聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）
一、目的要求
（1）學(xué)習(xí)電泳原理和技術(shù)
（2）學(xué)習(xí)和掌握SDS－聚丙烯酰胺凝膠圓盤(pán)電泳分離蛋白質(zhì)技術(shù)
二、實(shí)驗(yàn)原理
聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺（簡(jiǎn)稱(chēng)Acr）單體和少量交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺（簡(jiǎn)稱(chēng)Bis）通過(guò)化學(xué)催化劑（過(guò)硫酸銨），四甲基乙二胺（TEMED）作為加速劑或光催化聚合作用形成的三維空間的高聚物。聚合后的聚丙烯酰胺凝膠形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。具有濃縮效應(yīng)、電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)。血清蛋白在聚丙烯酰胺凝膠電泳一般可分成12～25個(gè)組分。因此適用于不同相對(duì)分子質(zhì)量物質(zhì)的分離，且分離效果好。
聚丙烯酰胺凝膠作為電泳材料的特性
人工合成聚丙烯酰胺凝膠的化學(xué)體系的組成及功能：
Acr：丙烯酰胺
Bis：甲叉雙丙烯酰胺
AP：過(guò)硫酸銨——化學(xué)催化劑
TEMED：四甲基乙二胺——加速劑
SDS是一種陰離子去垢劑，SO32-帶負(fù)電荷。在含有強(qiáng)還原劑的SDS溶液中可形成SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物。由于結(jié)合大量帶負(fù)電荷的SDS，好比蛋白質(zhì)穿上帶負(fù)電的“外衣”，蛋白質(zhì)本身帶有的電荷則被掩蓋了。從而起到消除各蛋白質(zhì)分子之間自身的電荷差異的作用。
三、實(shí)驗(yàn)材料
（一）試劑
1、30%丙烯酰胺混合液（Acr:Bis 為29:1） 稱(chēng)取丙烯酰胺（Acr）29g及甲叉丙烯酰胺（Bis）1.0g，用去離子水溶解并稀釋至100ml，貯棕色瓶中于4℃保存，可用一個(gè)月。
2、1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl緩沖液 取1mol/L HCL溶液48ml、三羥甲基甲烷（Tris）36.6g，加雙蒸餾水至80ml使其溶解，調(diào)pH至8.8，然后用雙蒸餾水稀釋至100ml，置棕色瓶中，4℃貯存。
3、1.0mol/LpH6.8Tris-HCl緩沖液 取1mol/L HCL溶液48ml，Tris5.98g，加雙蒸餾水至80ml，調(diào)pH6.8，用雙蒸餾水稀釋至100ml，置棕色瓶中，4℃貯存。
4、Tris-甘氨酸電泳緩沖液 稱(chēng)取Tris 6g、甘氨酸28.8g，加蒸餾水850ml，調(diào)pH至8.3，加蒸餾水到1000ml，4℃貯存。用時(shí)可做10倍稀釋。
5、10% 過(guò)硫酸銨（AP）（6）四甲基乙二胺（TEMED）或β-二甲基氨基丙腈（DMAPN）。
6、10%SDS（十二烷基磺酸鈉） 稱(chēng)取SDS 10g，加蒸餾水100ml使其溶解。
7、四甲基乙二胺（TEMED）
8、上樣緩沖液 取1.0mol/LpH6.8Tris-HCl緩沖液6.25ml，蔗糖10g，SDS 2.3g，1g/L溴酚藍(lán)10ml，加蒸餾水溶解，混合至100ml。
9、考馬斯亮藍(lán)染色試劑 考馬斯亮藍(lán)R250染色液：濃度為2.5g/L，用甲醇∶醋酸∶蒸餾水=5∶1∶5的溶液配制（V/V）。
10、脫色液：取冰醋酸7.5ml、甲醇5ml，加蒸餾水至100ml。
11、樣品：人血清。
12、蛋白質(zhì)分子量標(biāo)志物 市售中分子量蛋白質(zhì)分子量標(biāo)志物。也可選擇5種以上的已知分子量蛋白質(zhì)自行配制，注意其分子量分布要能滿(mǎn)足需要，各種蛋白質(zhì)的濃度基本相等。
（二）儀器 圓盤(pán)電泳槽（或垂直板電泳槽）、穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 、脫色搖床。
四、實(shí)驗(yàn)方法
（一）準(zhǔn)備圓盤(pán)電泳槽、電泳儀。
（二）凝膠制備 按下表分別配制分離膠和濃縮膠（此量可供2人用）
分離膠(12% 5ml) 濃縮膠(5% 2ml)
ddH2O 1.6ml 1.4ml
30%混合液 2.0ml 0.33ml
1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl 1.3ml —
1.0mol/L pH6.8 Tris-HCl — 0.25ml
10%SDS 50µl 20µl
10%Ap 50µl 20µl
TEMED 4µl 4µl
注意：邊配邊平搖燒杯混勻，配好膠后迅速用滴管灌膠
（三）灌膠
1、先將膠管（5х90mm）封好底，將配制好的分離膠液灌注入膠管內(nèi)，約70mm高度（掌握分離膠的高度），在凝膠表面輕輕加一層正丁醇液（約3～4mm）。用于隔絕空氣，使膠面平整。室溫下靜置約30～60min。觀察膠和正丁醇之間的界面，判斷膠是否凝固。要在確認(rèn)分離膠徹底凝固后才開(kāi)始配制濃縮膠。
2、分離膠凝固好后，倒掉覆蓋在分離膠表面的正丁醇，并用去離子水沖洗一次，倒置吸凈殘留的水。將配制好的濃縮膠液灌注入膠管內(nèi)（約15mm），在凝膠表面輕輕加一層正丁醇液（約3～4mm），用于隔絕空氣，使膠面平整。室溫下靜置約30～60min。觀察膠和正丁醇之間的界面，判斷膠是否凝固。膠凝固好后，倒掉覆蓋在膠表面的正丁醇，并用去離子水沖洗一次，倒置吸凈殘留的水，準(zhǔn)備加樣。
（四）樣品預(yù)處理和加樣
1、取血清0.1ml、上樣緩沖液0.9ml，混勻，在沸水中煮沸5min。
2、將膠管封底去掉，放入圓盤(pán)電泳槽中，套緊，不能有空的孔，將Tris-甘氨酸電泳緩沖液加入圓盤(pán)電泳上、下槽中，電泳緩沖液要蓋過(guò)膠管口，然后用微量加樣器（或注射器）將樣品10μl加到膠管膠面內(nèi)。
（五）電泳 上槽接負(fù)極，下槽接正極，先調(diào)電壓為120v/濃縮膠，開(kāi)始電泳，當(dāng)指示染料進(jìn)入分離膠后，將電壓增加到80v/分離膠膠，繼續(xù)電泳直至染料抵達(dá)距分離膠下端約1cm處，停止電泳，斷開(kāi)電源。電泳時(shí)間約1.0~1.5h。
（六）考馬斯亮藍(lán)染色
電泳結(jié)束后，取出電泳膠管，用長(zhǎng)注射器針剝膠，一邊注水一邊推膠，直至膠出。將膠移至大培養(yǎng)皿中，精確量取并記錄凝膠長(zhǎng)度和指示染料的遷移距離（分離膠上緣到染料條帶中心距離），然后將凝膠板浸入考馬斯亮藍(lán)染色液中0.5-1h，再用脫色液脫色1~2天，至背景無(wú)色為止。區(qū)帶可作定性或定量分析。
（七）校正曲線的數(shù)據(jù)處理和分子量測(cè)定 精確量取并記錄染色后凝膠長(zhǎng)度、各標(biāo)志蛋白質(zhì)和各待測(cè)蛋白質(zhì)區(qū)帶的遷移距離（分離膠上緣到各蛋白質(zhì)區(qū)帶中心）。按下式計(jì)算各蛋白質(zhì)的相對(duì)遷移率（Rm值）。
Rm =
在半對(duì)數(shù)紙上，以各標(biāo)志蛋白質(zhì)的Rm值為橫坐標(biāo)（普通尺度），相應(yīng)的分子量為縱坐標(biāo)（對(duì)數(shù)尺刻度）作圖，即得分子量校正曲線。根據(jù)各待測(cè)蛋白質(zhì)的Rm值，查此校正曲線，可求各待測(cè)蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量。
五、注意事項(xiàng)
1．制膠過(guò)程中用正丁醇封住膠面是為了阻止空氣中的氧氣對(duì)凝膠聚合的抑制作用。
2．本法也適合于其他生物樣品中蛋白質(zhì)的分析。上樣量不宜過(guò)大，否則會(huì)出現(xiàn)過(guò)載現(xiàn)象。尤其是考馬斯亮藍(lán)R250染色，在蛋白質(zhì)濃度過(guò)高時(shí)，染料與蛋白質(zhì)的氨基(－NH)形成的靜電鍵不穩(wěn)定，其結(jié)合不符合Beer定律，使蛋白質(zhì)量不準(zhǔn)確。
3．Acr和Bis有神經(jīng)毒性，可經(jīng)皮膚、呼吸道等吸收，故操作時(shí)要注意保護(hù)。
附表1 分子量范圍與凝膠濃度的關(guān)系
蛋白質(zhì) 核酸(RNA)
分子量范圍 適用的凝膠濃度/(%) 分子量范圍 適用的凝膠濃度/(%)
<104 20-30 <104 15–20
1-4×104 15-20 104–105 5-10
1-5×104-1×105
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